课堂 | 如何成功分离并鉴定新型冠状病毒毒株？——意义及实验详解

疫情背景

2020年的春天，整个神州大地被新冠病毒疫情肆虐；所幸是各大科研机构全力开展科研攻关，让我们看到了曙光和希望。

2月7日，复旦大学成功分离并鉴定出新型冠状病毒毒株，实验室已基本完成该病毒株的全基因组序列测定和分析，与新型冠状病毒（2019-nCov）参考基因组（EPI_ISL_402119,GISAID）相比，同源性大于99.9%。随后，多地也出现了分离毒株的成功案例[1]。

间接免疫荧光显示病毒感染的细胞呈现合胞体——来源：复旦大学

闻玉梅院士与上海市疾病预防控制中心挑选多例确认病例的鼻/咽拭子样本用于实验，基础医学院新型冠状病毒攻关团队通过使用两种细胞系（vero-E6和Huh7细胞）接种样本，从一例病例样本中，于2月7日成功分离并鉴定出新型冠状病毒（2019-nCoV）毒株，该毒株在细胞培养中扩增迅速，可得到较高滴度的病毒；间接免疫荧光法发现病毒感染细胞显示典型冠状病毒样病变-合胞体。目前，实验室已基本完成该病毒株的全基因组序列测定和分析，与新型冠状病毒（2019-nCov）参考基因组（EPI_ISL_402119, GISAID）相比，同源性大于99.9%。经进一步纯化、扩增和鉴定后，该毒株将为新型冠状病毒疫苗、抗病毒药物研制和致病机理研究等提供重要的毒种资源[1]。

病毒毒株的定义与分离意义

病毒毒株是什么？

毒株是在实验室条件下培养的病毒。就是病毒的原生体[2] 

不管是对抗哪种病毒，都要进行科学检测与实验，而这些都需要把病毒毒株分离出来。有了毒株，才能进行动物实验，临床实验，后面才能研发疫苗或相关药物。

病毒毒株的分离有什么意义？

1、通过抗体检测方法判断和评估人群真实感染情况，对于了解病毒入侵人体的机制具有重要意义。

2、病毒毒株分离后，经进一步纯化、扩增和鉴定后，将为病毒疫苗、抗病毒药物研制和致病机理研究等提供重要的毒种资源。

3、可以用于开展制备疫苗的研究，这对未来预防疾病具有重要意义。

4、对选择和制造新型冠状病毒的治疗药物，诊断试剂的开发均具有重要意义。

作为一种新发现的病毒，新型冠状病毒的性状、致病性、易感器官、致病机理、药物敏感性以及流行规律都还不是很清楚，所以这次病毒的成功分离将为这些研究提供有力的病原学支撑。

简单来说，有了这株毒株，相当于我们在和病毒的战争中抓了一个俘虏。帮助我们识别它们，我们进行动物实验，直接观察病毒如何侵害机体器官，主要侵害哪些器官，会造成什么样的症状，甚至推断出在人体的致病模型，这些将是我们指导临床治疗的科学基础。我们最终战胜病毒的武器之一。

分离并鉴定新型冠状病毒毒株实验流程图

值得注意的是，不同于细菌，可以用琼脂、肉汤等形成外部的营养环境，通过大规模的发酵和浓缩来进行制取; 病毒必须依靠宿主细胞中的资源来进行自身的复制、释放完整病毒颗粒；因此它的分离扩增要通过细胞来进行培养。

免疫荧光技术——显示病毒感染的细胞

间接免疫荧光法可以成功的发现分离出来的新冠肺炎病毒，其中关键设备之一为生物荧光显微镜。事实上，荧光显微镜早就广泛用于呼吸道感染的快速临床检测。

免疫荧光技术（IF）又称免疫抗体技术，是一种以荧光素标记抗体（抗原）而进行抗原（抗体）定位的技术。该技术无放射性污染，且操作简便，特异性强、灵敏度高、检测速度快，成为临床检验中最常用的检验手段之一。[3]

应用最为广泛的荧光素为异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothinocyanate，FITC），其在蓝光的激发下呈现明亮的黄绿色荧光；是针对呼吸道疾病免疫荧光检测用试剂的常用荧光素。目前临床应用比较广泛的，是围绕FITC染料的，美国的呼吸道七联检试剂盒和西班牙的九项IgM抗体检测试剂盒。

下面我们通过赏析一篇文献来详细看一下：

文献赏析——通过蛋白冠状构造合成类病毒颗粒使冠状病毒感染禽类模型的有效接种成为可能[4]

• Hui-Wen Chen. Department of Veterinary Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

• Biomaterials Volume 106, November 2016, Pages 111-118 （2019 IF: 10.273 ）

• 文献研究证明了一种简单而可靠的方法来用合成纳米颗粒连接病毒抗原;  改进疫苗应用。

• 使用荧光显微镜Leica DMi8，进行成像，分析定量。

• 染色：FITC标记的抗小鼠IgG (Jackson Immu- noResearch Laboratories)孵育1小时。用DAPI 复染。

这篇文献涉及的对抗的冠状病毒coronavirus有SARS-CoV和MERS-CoV，并非引发今次疫情的2019新型冠状病毒（又称严重急性呼吸道综合征冠状病毒2型，SARS-CoV-2）。但它们同属冠状病毒亚科（Coronavirus），是不同的变种。[5]

8周大BALB/c小鼠通过爪垫内（intra-footpad）注射50 mL PBS自由蛋白制剂，或含有2mg病毒抗原的sVLPs 。24 h后，处死小鼠和收割腘窝淋巴结 (n ¼ 6). 制作冰冻切片(6 mm) (n¼6)。冰冻切片(6 mm)在丙酮中固定10min,  1%多聚甲醛中固定8min。切片用5%正常山羊血清PBS溶液阻断10分钟，并用anti-S mAb 室温下孵育4h。冲洗后，切片进一步在FITC标记的抗小鼠IgG（FITC-conjugated anti-mouse IgG (Jackson Immuno Research Laboratories)）室温下孵育1小时。细胞核用DAPI染色，以显示所有细胞。荧光信号在Leica DMi8荧光显微镜(Leica DMi8)下观察，成像分析定量。[4]

sVLPs的抗原递送和免疫原性： (A)腘窝淋巴结切片在明亮视野下(上图)进行免疫荧光检测(bottom panel). 淋巴结切片用DAPI(蓝色)和FITC标记的anti-IBV spike蛋白抗体(绿色)染色，以检测淋巴结内抗原含量 (B)抗原荧光信号的量化的淋巴结。Bars represent means ± s.d. (n ¼ 6). (C)接种疫苗后14和21天，量化anti-IBV spike蛋白质的免疫球蛋白浓度。[4]

实验关键利器——荧光显微镜DMi8

• 同一品牌

• 高度整合，高度智能化

• 软硬件协调工作，故障率少

1、领先光学——LEICA大视野

25mm 目镜视野，19mm 成像视野， 保证更大的可视面积，单一视野更多观察目标；更易搜索目标视野。

2、先进技术——LEICA高精度

DMi8 系统的一大特色为以 20 nm 的重定位精度实现闭环调焦。在增大的 12 mm 调焦行程的基础上，选择闭环调焦，实现多点间歇摄取实验的高再现性。

3、高稳定性：长期焦面保持 – 三重保障

AFC——徕卡自适应调焦控制

只需单击一次按钮，具有 LED 光束辅助功能的徕卡自适应调焦控制 (AFC) 即可自动实时维持对焦。

节省时间，确保您的间歇成像摄取不受实验条件变化的影响。

小鼠胚胎发育（荧光标记组蛋白变体H3.3）连续观察32 h

4、看得更快 – 实验速度加快5倍

配有 LAS X Synapse 高级同步快速板的 DMi8 S 成像解决方案消除了系统组件间的瓶颈，从而大大加快了成像速度。通过集成的实时控制器，直接与所有硬件组件、相机和外围设备关联，您可以毫秒级的精度控制您的整个系统。

将多位置载物台实验与高速外部荧光转换功能相结合，发挥市场上配合高精度载物台控制的快速滤片转盘的优势。

间歇摄取实验时间最高缩短5倍意味着您不但可以节省时间，还能获得更多细节。不管实验中使用了哪种仪器组件，系统都将以最高可能的速度运行。

带 LAS X Synapse 的 DMi8 S 可更高效地处理数据，帮助您实现较高的摄取速度。

升级来了——革新宽场成像：THUNDER系统

共聚焦的成像质量，宽场的成像速度！

新品：高分辨高速多维成像系统THUNDER

使用 Alexa Fluor 568 Phalloidin (肌动蛋白) 和 YOYO 1 iodide (细胞核) 染色的 HeLa 细胞球状细胞团

• 绝佳高清成像： 

136nm光学分辨率 3D 样品进行清晰成像

• 高速多维成像：

3.5分钟内完成96孔板Z-stack多层扫描

2分钟内完成荧光玻片扫描

• 低光毒性：

LED冷光源照明，高灵敏成像，保护标本活性，减少荧光淬灭

• 操作简单：

一键成像，实时出图

THUNDER Imager – 高分辨率

• XY方向：136nm光学分辨率，比普通宽场2X提高

• XZ方向：264nm光学分辨率，比普通宽场2.5X提高

THUNDER Imager – 高速，多维实时成像

THUNDER是建立在宽场基础上的，在高分辨率的同时，保留了宽场成像快速的优势。

单维度：每秒90幅2048*2048。

多维度：1920x1440像素，3通道，10层Z，96孔板扫描，3分30秒以内完成！

THUNDER Imager – 应用广泛

Figure R: Volume rendering of a Computationally Cleared 150um brain section

Z轴扫描平均深度：150um，三维重建示例。

THUNDER看得更多 – 观察面积增大到 10,000倍

从一张张图像搜索转变为看到样本的整个图像。软件模块  LAS X Navigator  就像是标本的 GPS导航，为您开辟一条通往高质量数据的清晰路线图。

创建样本的概览图，立即识别重要细节。然后使用载玻片、培养皿和多孔板模板，自动设置高分辨率图像摄取。

THUNDER看得更准确 –找到您的答案

不管您关注的是哪种实验，LAS X Navigator 始终是 DMi8 S 平台上通往所有应用的关键。

• 生成实时概览图

• 创建螺旋扫描，搜索当前位置的邻近区域

• 在标本夹模板中显示图像，进行快速定向

• 在相同工作空间中使用任何放大倍率、相机、检测器和反差方法

• 定义高分辨率扫描或多孔板成像项目的无限多个区域和位置

• 快速缩放标本

• 通过鼠标单击即可移动到载物台上的任何位置

斑马鱼幼鱼。来源：Ravindra Peravali, Institute of Toxicology and Genetics, Eggenstein-Leopoldshafen, Germany.

培养皮层神经元细胞，做59层Z轴断层扫描。绿色,beta-III-tubulin;蓝色,细胞核。

不仅仅可以观察培养细胞，对类器官也有卓越效果。

小鼠肺的类器官来源于肺泡茎和祖细胞。标本厚度200um。使用徕卡THUNDER 3D live cell系统以及20x 干镜，样品放置于1mm厚度的普通塑料底12孔板内。一样可得出清晰超凡的三维断层扫描效果。充分证明了THUNDER系统应用广泛的特点，不限物镜！不限样品器皿！

Sample courtesy Dr. Pumaree Kanrai, MPI for Heart and Lung Research, Bad Nauheim (Germany). 

参考文献：

[1] 复旦大学官网：https://news.fudan.edu.cn/2020/0211/c4a104005/page.htm

[2] 百度百科：https://baike.baidu.com/item/%E6%AF%92%E6%A0%AA

[3] 维基百科：https://zh.m.wikipedia.org/zh-hans

[4] Hui-Wen Chen. Department of Veterinary Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, Synthetic virus-like particles prepared via protein corona formation enable effective vaccination in an avian model of coronavirus infection, Biomaterials Volume 106, November 2016, Pages 111-118 （2019 IF: 10.273 ）

[5] 维基百科：https://zh.m.wikipedia.org/wiki/新型冠状病毒