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010-62419881
一支由耶鲁大学YSM、哈佛医学院BWH、苏黎世大学IMCR和乌得勒支大学的科学家组成的国际团队共同合作，发现肠神经系统分泌的IL-18介导粘膜免疫屏障。2020年1月9日，国际学术期刊《Cell》在线发表了这一成果[1]。在此篇文献研究中，使用了THUNDER Imager 3D live cell高分辨宽场系统。 《Cell》是与《Science》、《Nature》齐名的重要国际性刊物。《Cell》也是细胞生物学的最高期刊。2019最新的影响因子（Impact Factor）是 36.216。
肠道神经系统（enteric nervous system， ENS）广泛分布于肠道组织的每个角落，最新涌现的多个研究报道发现ENS可以调控肠道组织的免疫作用[2]。但是ENS怎么参与粘膜免疫的呢，媒介是什么，作用机制又是怎样的此前还未有研究成果。如今，以耶鲁大学医学院Richard A. Flavell和哈佛医学院布莱根妇女医院Roni Nowarski为首的这支国际团队，研究并揭示了肠神经系统(ENS)如何参与维持肠粘膜免疫屏障。在沙门氏菌等致病菌的侵袭过程中，宿主细菌在肠道内的防御是由ENS介导的。此研究使用了THUNDER系统进行smFISH成像，统计了特定ENS细胞中的RNA单分子的数量，验证了IL18广泛在小鼠结肠组织ENS中有表达[1]。
此表明，THUNDER 不仅仅提供清晰锐利的图像，统计意义上的量化分析结果也获得了国际权威期刊的认可。
文献链接：https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(19)31378-9.
文章中单分子荧光原位mRNA杂交smFISH成像均是使用THUNDERImager 3D live cell系统完成的
文献赏析：
Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity（肠神经系统分泌的IL-18参与粘膜免疫屏障）
文献简介：
粘膜免疫屏障是维持共生菌群和抵抗侵袭性细菌感染的必要条件。虽然过去普遍认为协调维护这种肠道稳态的是免疫细胞和上皮细胞，但在这篇新发表的文章中，作者证明肠神经系统(ENS)在其中也扮演着重要的角色。ENS产生的促炎细胞因子IL-18能诱导肠上皮细胞产生抗菌蛋白（AMP），抵抗肠道感染。
通过共聚焦显微镜单细胞成像和THUNDER的smFISH组织成像的结合，作者观察到肠神经系统产生促炎细胞因子IL-18。值得注意的是，仅仅在肠神经元中特异性敲除IL-18，可加剧小鼠的鼠伤寒沙门氏菌(S.t.)感染。说明源于肠神经的IL-18对于抵抗肠道细菌感染是必须的；而特异性敲除免疫细胞或肠上皮细胞中的IL-18，不会影响小鼠对S.t.肠道感染的易感性。文章再结合单细胞转录组技术来探究ENS来源IL-18的功能以及作用方式。最终发现ENS特异性来源的IL-18能诱导结肠杯状细胞增加表达抗菌蛋白AMP，从而抵抗致病菌的侵袭。说明肠神经系统是抵御肠道致病菌的重要免疫介质。
以下就是文中使用THUNDER Imager 3D live cell成像的smFISH图像，验证了肠神经系统ENS中的确广泛存在IL18的表达。
图2E用smFISH检测小鼠结肠组织中IL18 (红色)、Tubb3(白色) 的表达；DAPI(蓝色)表示细胞核。此图可观察到IL18 mRNA探针(红色)与神经元特异性Tubb3 mRNA探针(白色)的共定位。
实验方法：处死小鼠，取出结肠，用冷PBS冲洗。结肠组织纵向切开，铺于滤纸上。用4% 多聚甲醛PBS溶液固定3 h；随后用30% sucrose, 4% PFA PBS溶液4度过夜孵育。切成7mm厚度切片，并使用smFISH染色。设计的FISH探针库与Cy5 (IL18)、TMR (Tubb3)连接，smFISH探针集杂交(Moor et al.,2018)。封片前再去除ENS内的自发荧光信号。smFISH成像是在Leica THUNDER 3D Live Cell系统上进行的，使用自带的THUNDER Computational Clearing设置。 原文结论： 在小鼠中使用Il18 mRNA探针进行单分子荧光原位mRNA杂交（smFISH）。作者使用来自Il18 -/-小鼠的结肠切片验证了他们的Il18 mRNA探针的特异性。并观察到Il18 mRNA探针和神经元特异性Tubb3 mRNA探针有共定位（图2E）。总之，这些数据表明肠神经系统是结肠中IL-18的新型生产者。
图S1B 在野生型或 Il18-/- 的小鼠结肠中，通过smFISH 成像使 Il18 mRNA (白色) 和 DAPI (蓝色)可视化。数据显示Il18-/- 的小鼠结肠中Il18 mRNA探针的信号丢失。图中刻度尺代表25um。右边样图显示结肠传入背根神经节中指示基因的表达和分布。
关于单分子荧光原位杂交(smFISH)技术：
全称single-molecule fluorescence in situ mRNA hybridization (smFISH)，是研究单细胞基因表达能力的一种新的强有力的技术, 因为它能够检测和计数单个 RNA 分子。与深度测序方法互补, smFISH 提供了有关转录丰度的细胞间变异和特定 RNA 亚单位定位的信息。[3][4]
另外有smFISH相关文献表示，为了收集smFISH探针发出的最大数量的光子，更建议使用宽场技术。共焦显微镜会显著限制要收集的光的数量[5]，而宽场技术会是对smFIGH成像更好的选择。
当然，这篇发表在《CELL》的文献内也大量使用了共聚焦技术对大鼠结肠神经元进行单个细胞的免疫荧光成像。
综上所述，此文章很好地结合了共聚焦成像和高分辨宽场技术。采用THUNDER高分辨宽场技术对smFISH探针进行快速大面积结肠组织成像，在RNA角度检测到IL18 与Tubb3 的共表达，验证了有IL18在小鼠结肠组织ENS的普遍的总体表达；再结合了共聚焦技术对大及小鼠结肠组织分离的肌间神经丛的高倍成像，在蛋白的角度观察到IL-18和Tubb3共同表达在单个神经元细胞内。最后两种方法互相印证，得出了肠道神经系统ENS能产生抗炎细胞因子IL-18的结论。
这也是首次揭示了ENS能够产生抗炎细胞因子IL-18，抵抗致病菌的侵袭，维持肠黏膜免疫屏障。
THUNDER高分辨率快速的特点很好地满足了小鼠结肠组织切片smFISH快速大视野扫描。不仅仅提供清晰锐利的图像，由于成像速度快，能对组织进行大面积高清扫描，故此能用于后期的数据统计分析。文章以THUNDER的smFISH成像为基础，特定统计了ENS细胞中的RNA单分子的数量，验证了IL18广泛在小鼠结肠组织ENS中有表达。
再加上此前的以下两篇文章，THUNDER累计文章已达到三篇了。
Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish
2019年11月发表于《Developmental Biology》，IF 2.936，使用THUNDER Model Organism型号。[7]
参考文献：
[1] Jarret A., Jackson R., Duizer C., Healy E.M.,Zhao J., Rone J. M.,Bielecki P., Sefik E.,Roulis M.,Rice T., Sivanathan K.N.,Zhou T., Solis A.G.,Honcharova-Biletska H.,Ve´ lez E.,Hartner S.,Low J.,Qu R., Zoete M.R., Palm N.W., Ring A.M., Weber A.,Moor A.E.,Kluger Y.,Nowarski R., Flavell R.A. ,Enteric Nervous System-Derived IL-18 Orchestrates Mucosal Barrier Immunity, Cell 180, 50–63(2020).
[2]. Lai, N.Y., Musser, M.A., Pinho-Ribeiro, F.A., Baral, P., Ma, P., Potts, D.E., Chen, Z., Paik, D., Soualhi, S., Shi, H., et al. (2019).
[3] Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, (10), 877-879 (2008).
[4] Rahman, S., Zenklusen, D. Single-molecule resolution fluorescent in situ hybridization (smFISH) in the yeast S. cerevisiae. Methods Mol Biol. 1042, 33-46 (2013).
[5] Chen, J., McSwiggen, D., Ünal, E. Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis. J. Vis. Exp. (135), e57774, doi:10.3791/57774 (2018).
[6] Zohreh V., Sarajo M.,3, Stephanie R., Miriam B., Yuanfang L., Negar O., Geoffrey T., Ting S., Stephan G. N., Antonia R., Christian W., Andreas H., Uwe A. H., Wolfgang A. W., Molecular imaging of fibroblast activity after myocardial infarction using a 68Ga-labelled fibroblast activation protein inhibitor FAPI-04, J Nucl Med.,10.2967, (2019).
[7] Grimes, D.T., Patterson, V.L., Luna-Arvizu, G., Schottenfeld-Roames, J., Irons, Z.H., Burdine, R.D., Left-right asymmetric heart jogging increases the robustness of dextral heart looping in zebrafish, Developmental Biology (2019).
